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人結(jié)腸癌動(dòng)物皮下實(shí)體瘤模型的建立
人結(jié)腸癌動(dòng)物皮下實(shí)體瘤模型的建立黃文革 陳鳳英 郭芬芬 劉慰華 李婕 黃河清
【摘要】 【目的】 建立臨床背景清楚的結(jié)腸癌動(dòng)物皮下實(shí)體瘤模型，為結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制及治療策略的研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型？【方法】 采用組織塊直接移植法將收集到的12例結(jié)腸癌組織臨床標(biāo)本移植到免疫缺陷小鼠右側(cè)肩胛皮下，第1-2代用NOD-Scid小鼠；將每個(gè)病例的第2代皮下腫瘤，分別連續(xù)皮下接種至NOD-Scid小鼠和BALB/C裸小鼠兩組動(dòng)物中，傳代至第5代？觀察每個(gè)病例在兩種品系動(dòng)物的成瘤時(shí)間？標(biāo)本的成瘤率；進(jìn)行HE染色和CDX-2及 CK20免疫組化檢測(cè)？【結(jié)果】 本實(shí)驗(yàn)NOD-Scid小鼠組的第3代和第5代皮下移植瘤的病例成瘤率分別為92%?58%,BALB/C裸小鼠組的分別為75%?50%?病理切片顯示腫瘤組織細(xì)胞排列成不規(guī)則腺體狀，有病理性核分裂相？CDX-2?CK20染色呈陽(yáng)性？【結(jié)論】 初步建立了臨床背景清楚的人結(jié)腸癌的NOD-Scid小鼠和BALB/C裸小鼠皮下移植瘤模型，為進(jìn)一步研究結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)理及治療策略奠定基礎(chǔ)？
【關(guān)鍵詞】 結(jié)腸癌； NOD-Scid小鼠； 裸鼠； 移植瘤模型
Abstract: 【Objective】 To establish subcutaneous solid tumor mice models of human colon cancer which have clear clinical backgrounds. 【Methods】 12 clinical colon cancer specimens were first transplanted to the subcutaneous tissue of right shoulder in NOD-Scid mice by tissue transplantation, Then the passage 2 of the subcutaneous tumor in each cases were implanted contiguously into NOD-Scid mice and BALB/C nude mice, respectively, which were subcultured to passage 5 in mice. The time and rate of tumor formation, HE staining and immunohistochemical examination of CDX-2 and CK20 were observed during the experiment. 【Results】The rates of subcutaneous tumor formation of passage 3 and 5 were 92% and 58% in NOD-Scid mice, while 75% and 50% in nude mice, respectively. The pathological results showed that cells in tumor tissue were gland-like and arranged irregularly, in which pathological nuclear fission was observed. The immunohistochemical stain of CDX-2 and CK20 in cells were positive. 【Conclusions】 The subcutaneous solid tumor models of human colon cancer in NOD-Scid and nude mice were established preliminary, providing a technological foundation for further exploring the pathogenesis and therapy strategy of colon cancer.
Key words: colon carcinoma; NOD-Scid mice; nude mice; transplanted tumor model
多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome,PCOS），是青春期和育齡婦女常見的生殖內(nèi)分泌疾病，在育齡期婦女中發(fā)病率高達(dá)6% —— 10%[1],主要有月經(jīng)紊亂？持續(xù)性排卵障礙？高雄激素血癥？高胰島素血癥及卵巢多囊樣變等一系列表現(xiàn)；臨床表現(xiàn)異質(zhì)性，約50%的患者合并超重或肥胖？近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)該疾病的功能紊亂遠(yuǎn)超出生殖軸，PCOS患者具有肥胖？血脂血糖代謝紊亂等心血管病的高危因素，遠(yuǎn)期代謝和心血管疾病的危險(xiǎn)性增高？研究發(fā)現(xiàn)，PCOS女性內(nèi)皮功能損傷的發(fā)生率明顯高于正常人群[2],細(xì)胞間黏附分子-1（intercelluar adhesion molecule-1,ICAM-1）是反映內(nèi)皮功能障礙的標(biāo)志物[3]?本研究通過(guò)監(jiān)測(cè)POCS患者血清中sICAM-1的水平，探討PCOS患者血清sICAM-1與代謝之間的相關(guān)性，以預(yù)警其發(fā)生糖尿病？心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，以便臨床進(jìn)行早期干預(yù)治療？
1 材料與方法
1.1 研究對(duì)象
選擇2009年8月至2010年10月就診于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院不育與性醫(yī)學(xué)科門診的63例PCOS患者為觀察對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)符合2003年鹿特丹PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]?選擇同時(shí)期就診的29例無(wú)PCOS 表現(xiàn)，有正常月經(jīng)周期和排卵，血清生殖激素正常，由于輸卵管等其他原因所致不孕癥患者為正常對(duì)照組？按體質(zhì)指數(shù)BMI≥25 kg/m2為肥胖[5],將63例PCOS患者分為肥胖組（A組，30例）和非肥胖組（B組，33例），29例正常對(duì)照組分為非肥胖組（C組，20例）和肥胖組（D組，9例）；A組患者年齡（27.40 ± 2.53）歲，B組患者年齡（27.09 ± 5.91）歲；C組患者年齡（28.55 ± 4.40）歲；D組患者年齡（26.56 ± 3.64）歲？4組患者在年齡無(wú)明顯差異，均排除系統(tǒng)性疾病，6個(gè)月內(nèi)未進(jìn)行過(guò)可能影響下丘腦-垂體-性腺軸功能的藥物治療？
1.2 方法
1.2.1〓一般資料收集〓由專人對(duì)受試者測(cè)量身高？體質(zhì)量？血壓？腰圍？臀圍，并進(jìn)行以下計(jì)算：腰臀比（waist/hip ratio,WHR）=腰圍（cm）/臀圍（cm）？平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure, MAP）=（收縮壓+舒張壓×2）/3?
1.2.2〓基礎(chǔ)內(nèi)分泌標(biāo)本收集〓患者于月經(jīng)周期第2 —— 5天或閉經(jīng)患者陰道B超檢查沒有優(yōu)勢(shì)卵泡時(shí)早晨空腹抽外周靜脈血用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定基礎(chǔ)性激素？ 空腹血糖？血脂？胰島素？口服葡萄糖耐量（OGTT）試驗(yàn)的檢測(cè)：囑患者禁食8 h于次日早晨抽肘靜脈血，然后口服葡萄糖75 g,于服糖后60?120 min抽血測(cè)葡萄糖，采用特異性葡萄糖氧化酶法？放射免疫法分別測(cè)定空腹血糖？血脂？胰島素？并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment-insulin resistance,HOMA-IR）：空腹胰島素（mIU/L）×空腹血糖（mmol/L）/22.5?胰島素抵抗（insulin resistant,IR）診斷依據(jù)HOMA-IR≥2.5[6]?
1.2.3〓測(cè)定sICAM-1〓于抽空腹血糖當(dāng)日抽取外周靜脈血；采用雙抗體夾心ELISA測(cè)定法測(cè)定受試者血清中sICAM-1,各步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作？ELISA試劑盒由杰特偉生物公司提供？
1.3〓統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ± s）描述，兩組間各項(xiàng)指標(biāo)比較首先采用正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊則用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，方差不齊則采用t′檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的變量采用非參數(shù)檢驗(yàn)？sICAM-1與各變量關(guān)系采用Pearson積矩相關(guān)？Spearman積矩秩相關(guān)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05,雙側(cè)？
2 結(jié) 果
2.1 四組一般資料比較
四組一般資料比較見表1?
2.2 四組之間IR及向心性肥胖發(fā)生情況
四組之間IR及向心性肥胖發(fā)生情況見表2?
2.3 Pearson相關(guān)分析
�、傺錽ICAM-1與體質(zhì)量？BMI?WHR?TG?FINS?HOMA-IR?PCOS患病呈正相關(guān)（分別為r=0.275,r=0.290,r=0.379,r=0.315,r=0.326,r=0.324,r=0.560;P < 0.05），與HDL-C?收縮壓？舒張壓？TC?LDL-C?脂蛋白？OGTT0h?OGTT1h?OGTT2h無(wú)相關(guān)性（P > 0.05）（各指標(biāo)中n=92）？控制BMI這個(gè)影響因素之后對(duì)sICAM-1與血糖？血脂代謝指標(biāo)進(jìn)行偏相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)血清sICAM-1與WHR?TG?PCOS患病呈正相關(guān)（分別r=0.268;r=0.243,r=0.533,P < 0.05）？②PCOS患者血清sICAM-1與體質(zhì)量？BMI?WHR?TG?HOMA-IR呈正相關(guān)（分別r=0.302,r=0.295,r=0.248,r=0.309,r=0.249,P < 0.05）（各指標(biāo)中n=63），與HDL-C?收縮壓？舒張壓？TC?LDL-C?脂蛋白？OGTT0h?OGTT1h?OGTT2h無(wú)相關(guān)性（P > 0.05）？
3 討 論
PCOS患者約有35% —— 60%表現(xiàn)為肥胖，并且肥胖中80%表現(xiàn)為向心性肥胖[7]?向心性肥胖是心血管疾病一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素？本研究中PCOS患者向心性肥胖發(fā)生率為61.90%,其中肥胖型PCOS患者80%為向心性肥胖？國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)50% —— 70%的PCOS患者有IR[1]?IR能夠增加機(jī)體發(fā)生代謝綜合征的危險(xiǎn)，包括糖尿病？高血壓�。垦惓�？血液高凝狀態(tài)和心臟疾病等？本研究顯示PCOS患者IR發(fā)生率高達(dá)53.97%（其中A組76.67%,B組33.33%）？PCOS患者早期的代謝狀況特別是糖代謝的狀況研究較少見？本研究顯示，空腹血糖（OGTT0h）A組高于B組？OGTT1h?OGTT2h均顯示A組高于另三組；B組高于C組和D組？提示PCOS患者存在潛在的糖代謝異常？國(guó)外研究顯示約70%的PCOS患者血脂代謝異常，PCOS患者以高甘油三酯為特征[8]?本研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者總膽固醇？甘油三酯均高于對(duì)照組？PCOS患者TC?TG?LDL-C呈逐漸升高趨勢(shì)，而具有保護(hù)作用的HDL-C則呈逐漸降低趨勢(shì)？高密度脂蛋白的降低？膽固醇及血甘油三酯水平的升高，預(yù)示一些PCOS患者晚年發(fā)生心腦血管疾病的危險(xiǎn)性增高[9]?
上述實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)，PCOS患者具有肥胖？高胰島素血癥？脂代謝紊亂等心血管病的高危因素，遠(yuǎn)期發(fā)生代謝和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)增高？
PCOS患者存在內(nèi)皮功能失調(diào)且抵抗胰島素血管舒張效應(yīng)[10]?而動(dòng)脈內(nèi)皮功能受損是發(fā)生心血管疾病的啟動(dòng)機(jī)制和關(guān)鍵因子之一？ICAM-1為跨膜糖蛋白，是白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的重要黏附分子，由內(nèi)皮細(xì)胞表面脫落在血液中以可溶形式（ sICAM-1） 存在，可反映細(xì)胞表面粘附分子表達(dá)狀態(tài)，為內(nèi)皮功能障礙的早期標(biāo)志物？動(dòng)脈粥樣硬化的重要起始步驟是單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附，ICAM-1是介導(dǎo)這一過(guò)程的關(guān)鍵因子，在內(nèi)皮細(xì)胞受到刺激時(shí)合成便迅速增加，介導(dǎo)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮的粘附[3]?在動(dòng)脈粥樣硬化形成的初期ICAM-1在激活的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，纖維斑塊形成后，斑塊內(nèi)皮細(xì)胞仍強(qiáng)表達(dá)ICAM-1?本研究結(jié)果顯示A組及B組血清sICAM-1均顯著高于C組和D組，表明PCOS患者存在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的活化與功能異常？相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清sICAM-1與體質(zhì)量？BMI?WHR?TG?FINS?HOMA-IR?PCOS患病呈顯著正相關(guān)，與收縮壓？舒張壓？TC?LDL-C?脂蛋白？OGTT0h?OGTT1h?OGTT2h無(wú)相關(guān)性？控制BMI這個(gè)影響因素之后對(duì)sICAM-1與血糖？血脂代謝指標(biāo)進(jìn)行偏相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)血清sICAM-1與WHR?TG?PCOS患病呈正相關(guān)？PCOS患者血清sICAM-1與體質(zhì)量？BMI?WHR?TG?HOMA-IR呈正相關(guān)？提示sICAM-1與PCOS患者血脂代謝以及胰島素之間關(guān)系密切，但是與糖代謝之間的關(guān)系不甚明確？PCOS患者向心性肥胖加劇了脂代謝的紊亂，進(jìn)而可能引發(fā)內(nèi)皮功能紊亂，出現(xiàn)sICAM-1的升高？而PCOS患者的胰島素抵抗及高胰島素血癥進(jìn)一步加劇機(jī)體代謝紊亂以及內(nèi)皮功能紊亂的出現(xiàn)？究竟是PCOS血管病變導(dǎo)致血清中sICAM-1升高，抑或是sICAM-1引發(fā)PCOS疾病的發(fā)生及進(jìn)展，需要進(jìn)一步深入進(jìn)行研究？
PCOS 患者糖脂代謝紊亂？肥胖等癥狀使得其發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)大大增加，對(duì)于這些患者應(yīng)該高度重視其遠(yuǎn)期并發(fā)癥，早期進(jìn)行干預(yù)和治療，降低心血管疾病的發(fā)生率，提高生存質(zhì)量？本研究顯示血清sICAM-1與PCOS疾病以及HOMA-IR?糖脂代謝關(guān)系密切？sICAM-1可作為PCOS患者血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的標(biāo)志性指標(biāo)加以監(jiān)測(cè)，連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察sICAM-1含量的變化，可能對(duì)PCOS 患者的心血管疾病的防治有重要的指導(dǎo)作用？
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